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猪用生物制品及有关猪源原辅资猜中

  非洲猪瘟病毒核酸检测步骤

1  合用领域

1.1猪用及选取猪源原辅资料制备的生物制品制品及半制品。！。

1.2猪源毒种。！。 

1.3 猪源细胞及有关制品出产用细胞。！。

1.4其他猪源原辅资料（如组织、、血清、、胰酶衍生物等）。！。

2  取样和处置

2.1 疫苗

2.1.1  活疫苗  取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用合适稀释液别离稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。！。

2.1.2  灭活疫苗  取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处置。！。

2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗  取36 ml混合疫苗，参与正戊醇4.0 ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。！。取水相进行核酸提取。！。

2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗

2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗  取混合疫苗5.0 ml，摇匀，参与0.25 g解离剂CPG-odn（人为合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时，5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。！。

2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗  直接取混合样品进行核酸提取。！。

2.2 其他生物制品和半制品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处置；；液体制品及半制品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。！。

2.3 猪源毒种  取至少2支毒种。！。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提。！；；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。！。

2.4 猪源细胞  除还有划定外，取至少2瓶细胞浓度不少于10^7.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。！。

2.5 其他猪源原辅资料

2.5.1 猪组织  每种组织，别离取样和处置。！。取不少于2.0 g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。！。

2.5.2 猪血清  每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。！。

2.5.3 猪胰酶  干粉状胰酶，取至少2份样品，凭据使用情况别离配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提。！；；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。！。

2.5.4 其他猪源衍生物  固体、、液体或干粉状猪源衍生物，可别离按组织、、血清或干粉状胰酶的步骤进行取样和样品处置。！。

3  核酸提取

3.1 试剂和器材

3.1.1 试剂  凭据核酸提取步骤确定，如氯仿、、异丙醇、、无水乙醇、、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、、75%乙醇等。！。

3.1.2 仪器  核酸含量测定仪；；常温台式离心理；；旋涡振荡器；；水浴锅；；微量移液器1套（最大量程别离为10 ?l、、100 ?l、、200 ?l、、1000 ?l）。！。

3.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、、无菌吸头（0～10 ?l、、0～200 ?l、、100～1000 ?l）、、一次性乳胶手套。！。

3.2  操作法式（TRIZOL法），也能够选择其他等效核酸提取步骤提取样品中的DNA。！。

3.2.1 取样品250 ?l，参与750 ?l Trizol，颠倒混匀，室温搁置5分钟。！。

3.2.2 参与200 ?l氯仿，充分混匀，室温搁置10 分钟，4℃下以12000 g离心15 分钟。！。

3.2.3 弃去上清液，参与220 ?l无水乙醇，颠倒混合，15～30℃搁置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟，沉淀物为DNA。！。

3.2.4 弃去上清液，参与含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 ?l洗涤DNA，15～30℃搁置30分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟。！。反复一次。！。

3.2.5 参与75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉淀，15～30℃搁置20分钟，4℃2000 g离心5分钟。！？？煞锤匆淮，充分洗涤DNA沉淀。！。

3.2.6 弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，参与30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶化DNA，－20℃以下保留备用。！。

3.3  当苦衷项

3.3.1核酸提取试剂拥有侵蚀和强变机能力，应做好小我防护，佩带手套、、口罩和护目镜，预防液体飞溅到皮肤和眼睛。！。

3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要预防样品之间相互传染，最好使用带滤芯的枪头，且每次汲取取液体时均需更换枪头。！。

3.3.3为预防核苷酸降解，应预防核酸酶传染，使用的耗材均需无核酸酶。！。

3.3.4做好渣滓样品的无害化处置及操作台面的消毒处置。！。渣滓样品可通过高压灭菌或煮沸处置，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处置，操作台面使用1%卫可擦拭。！。

3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时利用枪头直接刺破锡箔纸取样，预防传染。！。

4  检测

下列两种步骤可任选其一。！。

4.1  实时荧光定量PCR检测法

4.1.1 试剂和器材

4.1.1.1 试剂

4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。！。

4.1.1.1.2 扩增引物及探针

扩增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10 ?mol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10 ?mol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 ?mol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3  无核酸酶的灭菌水  PCR级别。！。

4.1.1.2  仪器  荧光定量PCR仪；；微量移液器1套（最大量程别离为10 ?l、、100 ?l、、200 ?l、、1000 ?l）。！。

4.1.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、、0.2 ml薄壁PCR管、、荧光定量PCR 96孔板、、0.1 ml荧光PCR八连管、、无菌吸头（0～10 ?l、、0～200 ?l、、100～1000 ?l）、、一次性乳胶手套。！。

4.1.2  操作法式

4.1.2.1 样品DNA制备  依照前述步骤进行核酸提取。！。

4.1.2.2 反映系统的配制  配制比样品数量至少多4个的反映系统，同时设置强阳性、、弱阳性和阴性对照。！。在强阳性和弱阳性对照反映管平别离参与含有非洲猪瘟P72基因的尺度质粒DNA各3 ?l，在阴性对照反映管中参与3?l无核酸酶灭菌水。！。每个PCR反映管中应蕴含以下成分：

4.1.2.3  反映法式  将所有待检样品和强阳性、、弱阳性、、阴性对照反映管放在荧光定量PCR仪中，依照以下法式进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟，95℃15秒，58℃退火延长1分钟，45个循环（荧光信号网络在此阶段每次循环的退火延长时进行）。！。

4.1.2.4  了局判定

4.1.2.4.1  阈值设定  试验操作实现后，确定Ct值。！。Ct值为每个样品反映管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。！。

阈值设定准则：凭据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。！。

4.1.2.4.2  质控尺度

对照组的检测了局应切合以下情况，这次检测方为有效：

阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线。！。

强阳性对照的Ct 值应在18～22之间，并出现典型的扩增曲线。！。弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线。！。

4.1.2.4.3  判定

阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。！。

阳性：Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。！。

可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。！。重检后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，其他情况均判定为阴性。！。

4.2  通常 PCR检测法

4.2.1  试剂和器材

4.2.1.1  试剂

4.2.1.1.1 PCR试剂  10×PCR缓冲液（含25 mmol/l  Mg²⁺），DNA扩增酶，dNTP预混液。！。

4.2.1.1.2扩增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。！。

4.2.1.1.3  DNA分子量尺度品  DL500。！。

4.2.1.1.4  TAE电泳缓冲液  配制步骤见《电泳液尺度配制流程》。！。

4.2.1.1.5  1%琼脂糖凝胶板  在100 ml 1×TAE缓冲液中参与1g琼脂糖，加热消融，参与5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平搁置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。！。凭据样品数量选用合适的梳子。！。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液覆没胶面。！。

4.2.1.2 仪器  DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。！。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、、0.2 ml薄壁PCR管、、无菌吸头（0～10 ?l、、0～200 ?l、、100～1000 ?l）。！。

4.2.2 操作法式

4.2.2.1 样品DNA制备  依照前述步骤进行核酸提取。！。

4.2.2.2 反映系统的配制  配制比样品数量至少多3个的反映系统，同时设立阳性和阴性对照。！。在阳性对照反映管中参与非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 ?l，在阴性对照反映管中参与2.0 ?l无核酸酶灭菌水。！。每个PCR反映管中应蕴含以下成分：

4.2.2.3  反映法式  将所有待检样品及阳性和阴性对照反映管放在PCR仪中，依照以下法式进行扩增：94℃2分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；；72℃10分钟。！。4℃保留。！。

4.2.2.4  PCR扩增产品分析  取PCR扩增产品10 ?l，加6×加样缓冲液2.0 ?l，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳功夫30分钟。！。电泳实现后，用凝胶成像系统拍照，纪录检测了局。！。

4.2.2.5 了局判定

4.2.2.5.1 质控尺度

对照组的检测了局应切合以下情况，这次检测方为有效：

阴性对响应不出现257bp的特异性条带。！。

阳性对响应出现257bp的特异性条带。！。

4.2.2.5.2 判定

阳性：待检样品出现与阳性对照巨细一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产品可通过DNA测序进一步确定基因型。！。

阴性：待检样品未出现与阳性对照巨细一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。！。

4.3  当苦衷项

4.3.1检测过程中应遵循PCR尝试分区准则，即应分辨试剂配制区、、样本处置区、、核酸扩增区。！。

4.3.2应预防在含有靶序列的区域中使用引物，预防传染靶序列。！。